Germinación In vitro de Semillas.
La germinación in
vitro de semillas nos permite generar un gran número plántulas en un espacio
reducido en condiciones contraladas. El medio de cultivo es sólido y su
composición puede variar según las condiciones pero en general se suele
utilizar el medio MS (Murashige & Skoog), que
contiene todos los nutrientes y reguladores del crecimiento necesarios para estimular la germinación de
las semillas, así como para garantizar su desarrollo inicial para aclimatarla
posteriormente en otro recipiente con otro sustrato. También es posible
realizar la germinación in vitro utilizando como medio únicamente agar
bacteriológico. Como hemos indicado en el apartado de generalidades, es
necesario mantener unas condiciones de asepsia y esterilidad para evitar la
contaminación.
¿Qué aplicación tiene la germinación in vitro de
semillas?
Permite la germinación de
semillas bajo condiciones controladas que simulan los parámetros óptimos
naturales, ya que en muchas ocasiones, es difícil hacerlo en condiciones normales.
Por otra parte, muchas semillas se encuentran en estado de dormición y en
condiciones controladas en el laboratorio es posible romper esa dormición y
estimular su germinación. Otro aspecto a destacar es que existen especies como
por ejemplo las orquídeas, que producen gran cantidad de semillas pero éstas
son tan pequeñas que apenas contienen sustancias nutricias suficientes para su
germinación, por lo que requieren establecer una asociación simbiótica con un hongo. La germinación in
vitro evita los inconvenientes mencionados con anterioridad.
Procedimiento:
a) Esterilización
de las semillas: El tamaño de las semillas influye en el método empleado para
el proceso de esterilización. Las semillas generalmente se esterilizan en una
solución de lejía al 20% y se le añaden un par de gotas de Tween 20, que actúa
de mojante (crea una película alrededor de la cubierta de las semillas para
evitar que la lejía tenga un efecto perjudicial en el interior de la semilla),
se dejan las semillas en esta solución entre 10-15 minutos (si las semillas son
diminutas se emplea menos tiempo). Pasado este tiempo, se lavan las semillas
varias veces con agua destilada. Posteriormente se secan. Es recomendable
realizar este proceso en cámara de flujo de aire laminar para evitar
contaminaciones.
b) Medio de
cultivo: El medio puede cualquiera de los que hemos mencionado con
anterioridad, normalmente se utiliza el medio MS a pH 5.7, aunque se puede
hacer directamente con agar bacteriológico. Seguir las instrucciones del
fabricante. En el caso del agar bacteriológico una receta sencilla consiste en
disolver 10 g de agar bacteriológico en 1 L de agua destilada. Los medios de cultivo se deben esterilizar en
un autoclave. Tras el proceso de esterilización, "plaqueamos", es
decir, repartimos el medio en las placas Petri o en los recipientes que se
vayan a utilizar para la germinación in vitro y se deja gelificar. Este paso es
recomendable realizarlo en una cámara de flujo de aire laminar, aunque también
se puede hacer a la llama de un mechero en caso de no disponer de la cámara de
flujo de aire laminar. Los recipientes con el medio de cultivo que no se
utilicen en un tiempo corto se pueden conservar un tiempo hasta su uso en
cámaras frías.
c) Siembra:
Esterilizar unas pinzas metálicas con etanol. Coger las semillas una a una con
cuidado y posicionarlas en la superficie del medio y con una distancia
suficiente entre ellas para no entorpecer las germinación. Realizar esta
operación en cámara de flujo de aire laminar o a la llama de un mechero para
evitar contaminaciones. Posteriormente se deposita el recipiente cerrado
(comúnmente se sella con una tira de parafilm para evitar contaminaciones) en
la cámara de cultivo con el fotoperiodo (por ejemplo 15 h de luz) y la humedad
relativa adecuada hasta su germinación.
d) Aclimatación:
Tras la germinación, se extraen las plantulitas con cuidado del medio con unas
pinzas y se limpian de los restos de medio con un poco de agua en un
recipiente. En unas bandejas con alveolos se deposita el sustrato a base de vermiculita-turba (1:1), también
puede ser sustrato universal. Se hace un agujerito en el centro y se deposita
las plantulita. El sustrato debe estar previamente húmedo. Las plantulitas
pueden permanecer un tiempo adicional en la cámara de cultivo o bien pueden
estar en un mini invernadero. Pasadas unas semanas las plantitas han crecido lo
suficiente para trasplantarlas a un recipiente de mayor tamaño.
